清潔是指去除灰塵、污垢和有機污漬。清潔方法包括刷、吸、干擦、洗滌或用浸泡肥皂水或清潔劑的濕布拖擦。粉塵、污物以及有機物是微生物的棲身之所，并可能影響除污染劑（抗菌劑、化學殺菌劑以及消毒劑）的作用。
二氧化碳培養箱必須先經過清潔才能實現消毒和滅菌的目的，許多殺菌劑只對經過清潔過的物品才具有殺菌活性。清潔時必須使用與以后使用的消毒劑或殺菌劑化學性質上相容的試劑進行清潔、消毒。
1、清潔箱體表面：先拂去表面的灰塵，再用濕的海綿或軟布清洗，再用軟布擦干。如果有污物則用低濃度的清潔劑清洗，然后擦干。
2、清洗箱體內部：選擇合適的消毒劑。所有的物件和表面必須徹底清洗，然后用無菌水沖洗，再擦干或晾干。
3、清洗玻璃門：清洗箱內的玻璃門時使用的清潔劑和清洗培養箱內部時使用的相同。然后用蒸餾水漂洗，從而清除殘留的清潔劑，然后用軟布把門擦干。
消毒是指殺死微生物的物理或化學手段，但不一定殺死其孢子。滅菌是指殺死所有微生物，當二氧化碳培養箱內細胞受到污染時則需要采取滅菌措施。
一般，在二氧化碳培養箱內細胞沒有污染的情況下平均1-3個月徹底消毒一次。常用的3種消毒滅菌的方式是：液體消毒劑、紫外和干熱。
1、液體消毒劑：選擇對二氧化碳培養箱無腐蝕性的液體消毒劑，并且液體消毒劑的消毒效果好壞和很多因素有關。比如：場所的溫度、接觸時間、pH、穿透能力、有機物的反應。
這些因素中的一些很小的變化可能會造成去污劑的效力上大的不同。因此甚至在很有利的情況下，當最終要求必須無菌時，液體去污劑也不是完全可信賴的去污方法。
2、紫外消毒：一般先用蒸餾水清洗干凈后，再用培養箱自帶的紫外燈照射一天。當紫外燈在有遮光罩的情況下照射時，紫外線照射到腔體的次數很少。
3、干熱滅菌：當CO2培養箱用于污染危險區域時，干熱滅菌可作為清潔室內的附加手段。干熱滅菌采用6面直接加熱，加熱溫度高達125°C。這使得腔體能夠破壞細菌。高溫（125°C）在培養箱中保持2小時以上。
經過8小時的滅菌程序（包括2-3小時的預熱時間，具體情況取決于溫度），滅菌室內的溫度降低并恢復到37°C或上一個程序設定的溫度。
除了以上幾種方法外，還可以采用聯合殺菌的方法，幾種消毒滅菌的方法同時使用來達到徹底清潔的效果。
